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针对上述问题，陆军军医大学西南医院邓君、罗高兴、周兵华团队设计了纳米级工程复合物（Cu5.4O@LL-37/pDNA），该纳米复合体采用核-壳结构设计。其核心为超微型Cu₅.₄O纳米酶，可高效清除活性氧，增强炎症反应，并将病理性的创面微环境转化为促进再生的微生态位。顺利获得重塑微环境并激活上皮干细胞功能的纳米疗法，在糖尿病和感染模型中均加速了上皮化及伤口愈合。该治疗策略为实现慢性伤口的持久有效愈合给予了一种新途径。该文章于2026年3月15日以《Nanocascade Engineering Workshop for Synergistic Microenvironment Reprogramming and EpSC Revitalization in Precise Diabetic Wound Therapy》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202522987）。

图1. 纳米级联工程工作站设计示意图。A图顺利获得scRNA-seq分析显示慢性糖尿病伤口中EpSC增殖和分化能力下降。B图展示了Cu_5.4O@LL-37/pDNA核壳结构及其在伤口愈合中的作用机制。

（1）糖尿病伤口愈合受损的细胞学特征

scRNA-seq分析最终保留28637个细胞用于分析。无偏聚类和注释揭示了14个主要细胞谱系，包括表皮、基质和免疫细胞群体（图2a、图2b）。DW中的EpSCs数量显著减少，这对再上皮化至关重要（图2c）。对EpSC功能状态的KEGG通路分析显示，关键通路如Hippo、Wnt和Notch均下调（图2d）。PPI网络揭示了调控干细胞增殖（如SOX9、PCNA）和分化（如TP63、SMAD4）的关键基因（图2e）。DW组织中EpSC的分化潜能评分和增殖潜能评分显著低于AW组（图2f、图2g）。与AW组相比，DW中增殖标志物SOX9、PCNA及分化标志物SMAD4、TP63的表达显著降低（图2h、图2i），在糖尿病小鼠模型中也得到了相应验证（图2j、图2k）。

图2. 糖尿病与急性伤口愈合中EpSC的单细胞分析。A图scRNA-seq工作流程。B图UMAP可视化显示14个主要细胞谱系。C图显示糖尿病伤口中EpSC比例降低。D图KEGG通路分析显示EpSC中下调基因富集于Hippo、Wnt、Notch和细胞周期信号通路。E图PPI网络显示调控EpSC增殖和分化的核心枢纽基因。F-G图显示糖尿病伤口中EpSC的分化和增殖潜能评分显著降低。H-K图免疫荧光染色验证人源和小鼠样本中增殖标志物SOX9、PCNA和分化标志物SMAD4、TP63表达降低。

（2）炎症信号导致干细胞在干细胞培养皿中功能失调

与正常组织相比，DW中促炎信号通路的活性显著增强，尤其是TNF、CD40、CD70和LIGHT通路（图3a）。尽管上皮干细胞并非TNF信号的主要传递者，但网络中心性分析表明，它们在TNF和MIF信号通路中扮演了关键角色，直接参与了过度活跃的炎症交叉谈话（图3b）。关键炎症基因（如TNF、CCL8和IL1B）的表达水平与增殖基因（PCNA和SOX9）及分化基因（TP63和SMAD4）呈显著负相关（图3c），这表明上皮干细胞中增强的炎症状态与再生机制的抑制直接相关。LPS处理显著抑制了PCNA、SOX9、TP63和SMAD4的mRNA表达水平（图3d）。此外，Western blotting结果进一步验证了这一发现，显示LPS处理显著降低了这些基因的蛋白质表达水平（图3e、f）。

图3. 炎症信号驱动糖尿病伤口中EpSC功能障碍。A图CellChat分析显示糖尿病伤口中TNF、CD40、CD70、LIGHT等促炎信号通路显著增强.B图网络中心性分析显示EpSC是TNF和MIF信号通路的关键接收者。C图相关性热图显示炎症相关基因与增殖/分化基因呈显著负相关。D-F图LPS处理体外培养EpSC后，PCNA、SOX9、TP63、SMAD4的mRNA和蛋白表达水平显著降低。

（3）Cu5.4O@LL-37/pDNA的合成与表征

采用一步法合成了Cu₅.₄O纳米颗粒（图4a）。k8凯发软件将LL-37肽接枝到Cu₅.₄O表面，并顺利获得静电作用与负电荷的质粒DNA（pDNA）结合，形成Cu₅.₄O@LL-37/pDNA复合物（图4b）。干径测量显示Cu₅.₄O、Cu₅.₄O@LL-37和Cu₅.₄O@LL-37/pDNA的直径、流体动力学直径和zeta电位（图4c-e）。FTIR光谱（图4f）揭示了Cu₅.₄O@LL-37的特征峰，确认LL-37成功结合于Cu₅.₄O表面，且pDNA顺利获得静电作用结合在复合物表面。琼脂糖凝胶电泳（图4g）结果表明，Cu₅.₄O@LL-37/pDNA在质量比为10时达到pDNA负载峰值。

图4 . Cu_5.4O@LL-37/pDNA的合成与表征。A图合成示意图。B-C图TEM图像和粒径统计显示Cu_5.4O、Cu_5.4O@LL-37和Cu_5.4O@LL-37/pDNA的干态直径分别为4.71、5.98和38.1 nm。D-E图水合粒径和Zeta电位测量。F图FTIR光谱证实LL-37和pDNA成功结合。G图琼脂糖凝胶电泳显示N:P比为10时pDNA完全结合。

（4）Cu₅.₄O@LL-37/pDNA 纳米颗粒的转染及抗氧化作用

评估了Cu₅.₄O@LL-37/pDNA纳米颗粒在EpSCs中的转染效率及其抗氧化应激能力。转染72 h后，细胞存活率约为80%-90%，形态健康，符合人类表皮干细胞培养特征（图5a、b）。顺利获得建立LPS诱导的人表皮干细胞氧化应激损伤模型，k8凯发软件发现Lipo3000/pDNA组EpSCs的转染效率从46%显著下降至13.6%（图5c、d），而Cu₅.₄O@LL-37/pDNA组的转染效率与未经LPS处理的EpSCs相似，显示其在高氧化应激条件下仍保持较高转染效率。利用DCFH染色的代表性图像和定量分析（图5e、f），发现Cu₅.₄O@LL-37/pDNA有效清除了EpSCs中的过量ROS，这一结果也顺利获得流式细胞仪得到了证实（图5g、h）。结果显示，LPS处理显著诱导了上皮干细胞的凋亡，而Cu₅.₄O@LL-37和Cu₅.₄O@LL-37/pDNA显著抑制了凋亡（图5i、j）。

图5 . Cu_5.4O@LL-37/pDNA对EpSC的转染效率和ROS清除能力。A-D图显示在LPS诱导的氧化应激条件下，Cu5.4O@LL-37/pDNA保持高转染效率，而Lipo3000/pDNA转染效率显著下降。E-H图DCFH染色和流式细胞术显示Cu5.4O@LL-37/pDNA有效清除EpSC中过量ROS。I-J图流式细胞术显示Cu5.4O@LL-37和Cu5.4O@LL-37/pDNA显著抑制LPS诱导的细胞凋亡。

（5）Cu_5.4O@LL-37/pDNA对转染的胚胎干细胞的体外治疗作用

经LPS刺激的表皮干细胞进分别用PBS或实验组处理（图6a）。结果显示，实验组中有2891个显著上调基因和3730个显著下调基因，证实两组之间存在明显分离，表明处理导致显著的全局转录组变化（图6b）。KEGG通路富集分析显示，上调基因主要富集于与再生相关的PI3K-Akt和MAPK信号通路，而下调基因则富集于与炎症相关的IL-17、TNF和NF-κB信号通路（图6c、d）。GSEA进一步确认PI3K-Akt通路的富集得分为正，而IL-17通路的富集得分为负，显示出两者的富集和抑制趋势（图6e、f）。qRT-PCR检测显示，该制剂显著抑制了LPS刺激的表皮干细胞中IL-17和IL-6的mRNA表达（图6g）。与对照组相比，Cu₅.₄O@LL-37/pDNA处理组的EpSCs比例显著增加（图6h），并且在炎性条件下，处理组高表达终末分化基因Loricrin（LOR）（图6i）。

图6. 工作站逆转炎症抑制并恢复EpSC再生功能。A图RNA-seq实验设计示意图；B图PCA显示LPS+PBS组和LPS+Cu5.4O@LL-37/pDNA组转录组显著分离。C-D图KEGG通路富集分析显示上调基因富集于PI3K-Akt和MAPK信号通路，下调基因富集于IL-17、TNF和NF-κB信号通路。E-F图GSEA验证PI3K-Akt通路上调和IL-17通路下调。G图qRT-PCR显示工作站显著抑制IL-17和IL-6 mRNA表达。H图流式细胞术显示工作站处理组EpSC比例增加。I图qRT-PCR显示工作站处理组LOR表达升高。J图EdU掺入实验显示工作站促进细胞增殖。

（6）Cu_5.4O@LL-37/pDNA的体外抗菌效应评价

如图7a所示，CFU平板显示，在0.3-1.2 µg/mL浓度范围内，MRSA的抑制率显著提高，并在1.2 µg/mL时接近100%的稳定值（图7b）。大肠杆菌也呈现类似趋势，随浓度增加，抑制效果显著增强（图7c）。SEM观察表明，与对照组光滑膜结构相比，Cu₅.₄O@LL-37/pDNA处理的细菌表现出严重的形态学损伤，包括显著变形和膜皱褶（图7d）。顺利获得细菌生物膜破坏实验，发现Cu₅.₄O@LL-37/pDNA处理组的生物膜显著破坏（图7e），该结果顺利获得结晶紫染色得到验证（图7f、g）。为探讨抗菌机制，采用NucGreen/EthD-III双重染色法评估细菌膜完整性（图7h）。Cu₅.₄O@LL-37/pDNA组和Cu₅.₄O@LL-37组显示更强的红色荧光信号，表明这些处理能使EthD-III渗透至细菌DNA中，进一步证实了其杀菌活性（图7i）。后续蛋白质渗漏定量分析显示，这种膜损伤导致细胞重要成分的可逆性流失（图7j）。

图7. Cu_5.4O@LL-37/pDNA的体外抗菌效果。A-C图菌落计数显示工作站对MRSA和大肠杆菌呈剂量依赖性杀菌作用。D图SEM显示工作站处理后细菌膜严重变形和破裂。E-G图SEM和结晶紫染色显示工作站显著破坏细菌生物膜。H-I图NucGreen/EthD-III双染显示工作站处理组细菌膜完整性严重受损。图蛋白泄漏测定显示工作站处理导致细菌内容物不可逆泄漏。

（7）该材料对双水合物的治疗效果

为了验证该复合物的临床治疗效果，k8凯发软件在db/db糖尿病小鼠上建立了全层皮肤创面模型（图8a）。结果表明，接受复合物处理的组在各时间点均显著加速伤口愈合（图8b），到第7天，Cu₅.₄O@LL-37/pDNA组的伤口愈合率显著高于其他组，且至第12天接近完全愈合（图8c）。H&E染色结果表明新生表皮显著延长，肉芽组织较厚，表明上皮化和真皮再生能力增强（图8e-g）。经Cu₅.₄O@LL-37/pDNA处理的伤口最佳的胶原沉积质量（图8h、i）。顺利获得CD31免疫荧光染色评估微血管密度，结果显示新生血管数量显著增加，证明其促血管生成作用（图8j、k）。此外，该复合物显著降低了伤口内氧化应激水平（图8l、m）。证实Cu₅.₄O@LL-37/pDNA处理显著恢复了K14阳性表皮干细胞（EpSCs）中分化标志物（SMAD4和TP63）及增殖标志物（SOX9和PCNA）的表达（图8n-p）。

图8. 工作站促进糖尿病小鼠模型伤口愈合和组织再生。A图实验设计示意图。B-C图伤口照片和定量分析显示Cu5.4O@LL-37/pDNA组伤口闭合速度显著加快。D图伤口闭合过程示意图。E-G图H&E染色显示工作站组新生表皮长度和厚度显著增加。H-I图Masson三色染色显示工作站组胶原沉积最丰富。J-K图CD31免疫荧光染色显示工作站组微血管密度显著增加。L-M图DHE染色显示工作站组ROS水平显著降低。N-P图免疫荧光染色显示工作站组K14阳性EpSC中SMAD4、TP63、SOX9和PCNA表达显著恢复。

（8）经处理的DWs的体内转录组图谱

PCA结果显示，两组的转录组谱明显分离，表明该复合物在伤口微环境中引发了显著的基因表达变化（图9a）。差异表达基因进一步证实了这种转录重编程（图9b）。上调基因显著富集于参与组织再生和修复的信号通路，如PI3K-Akt、MAPK、TGF-β和mTOR信号通路。而下调基因则富集促炎性信号通路，包括IL-17、NF-κB和TNF通路（图9c）。GSEA结果显示促炎通路受到显著抑制（图9d-f）。与此同时，与细胞生长、增殖及组织重塑相关的通路被激活，TGF-β信号通路表现出显著的正向富集，而MAPK通路也呈现出正向富集趋势（图9g-i）。

图9. 体内伤口组织转录组分析揭示工作站的免疫调节和促再生机制。A图PCA显示对照组和工作站组转录组显著分离。B图差异表达基因热图。C图KEGG通路富集分析显示促炎信号通路下调，再生相关通路上调。D-I图GSEA验证NF-κB、TNF和IL-17通路显著抑制，TGF-β、mTOR和MAPK通路上调。

（9）该材料对受感染的DWs的治疗效果

与对照组相比，Cu₅.₄O@LL-37/pDNA显著加速了伤口愈合（图10a），定量分析表明所有时间点处理组均实现了更高的愈合率（图10b）。图10c示意了这一加速愈合过程。第12天的组织学分析显示H&E染色中复合制剂组呈现良好的新生表皮和细胞密集的肉芽组织（图10d），上皮化长度和表皮厚度均显著增加（图10e、f）。复合处理组具有丰富且有序的胶原沉积（图10g），定量分析证实胶原比例显著增加（图10h）。微血管密度显著增加，表明其促血管生成作用（图10i、j）。DHE染色结果表明，复合材料显著降低了伤口的荧光强度，显示出强大的ROS清除能力，有效缓解了伤口微环境中的氧化应激（图10k、l）。此外，针对感染性模型，对伤口细菌负荷进行定量测定，结果显示Cu₅.₄O@LL-37及完整的Cu₅.₄O@LL-37/pDNA制剂均显著降低了细菌负荷（图10m、n）。

图10. 工作站对感染性糖尿病伤口的治疗效果。A-C图伤口照片和定量分析显示工作站组伤口闭合速度最快。D-F图H&E染色显示工作站组新生表皮长度和厚度最大。G-H图Masson三色染色显示工作站组胶原沉积最丰富。I-J图CD31免疫荧光染色显示工作站组微血管密度最高。K-L图DHE染色显示工作站组ROS水平最低。M-N图菌落计数显示工作站组细菌负荷显著降低。