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针对上述问题，中国人民解放军空军军医大学西京医院杨薛康教授、西北工业大学彭勃教授与澳大利亚蒙纳士大学Nicolas H. Voelcker教授团队合作，开发了一种新型的“杂交膜人工细胞外囊泡”平台，称为C@AH-EVs。该平台整合了仿生双靶向膜与线粒体 ROS 激活型前药，实现对巨噬细胞线粒体的精准靶向和 ROS 响应性抗氧化治疗，成功重塑巨噬细胞表型、减轻炎症并加速糖尿病创面愈合，为慢性炎症相关疾病给予了全新治疗策略。该文章于2026年2月28日以《Hybrid macrophage-mitochondria extracellular vesicles for mitochondrial ROS regulation in diabetic wounds》为题发表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-026-69383-3）。

图1. 按需清除线粒体活性氧的人工细胞外囊泡用于糖尿病伤口愈合的设计

（1）ROS 响应型前药 CAPE-FPBA-DO 与 CA-FPBA-DO 的合成与表征

研究团队完成了两种 ROS 响应型前药的合成、表征与性能筛选。一是顺利获得核磁共振与紫外 - 可见光谱，证实 CAPE-FPBA-DO 与 CA-FPBA-DO 成功合成，且均符合 Oprea 成药性规则；二是 CCK-8 实验显示 CAPE-FPBA-DO 细胞毒性显著更低，IC50 达 106.6 μM，远高于 CA-FPBA-DO 的 28.95 μM；三是稳定性实验证实 25 μM 浓度下 CAPE-FPBA-DO 的水解稳定性显著更优；四是体外释放实验显示两种前药均具有 H2O2 浓度依赖性释药特性，1 mM H2O2 环境下 480 min 时 CAPE-FPBA-DO 累计释放率达 77.77%，优于 CA-FPBA-DO；五是 ABTS 实验证实前药水解后释放的 CAPE 与 CA 具备强效抗氧化活性，最终筛选 CAPE-FPBA-DO 为核心载药成分。

图2. CAPE- FPBA -DO与CA- FPBA -DO的合成与表征。a ROS触发CAPE/CA从CAPE/CA- FPBA -DO中释放的示意图。b CAPE、2- FPBA 、DO（十二烷醛）及CAPE- FPBA -DO的紫外-可见光谱。紫外-可见光谱为三次独立实验的代表性数据。c CA、2- FPBA 、DO及CAPE- FPBA -DO的紫外-可见光谱。紫外-可见光谱为三次独立实验的代表性数据。d RAW 264.7细胞的半抑制浓度分析（n = 3个生物学独立样本）。e 顺利获得紫外-可见光吸收监测25 μM CAPE- FPBA -DO与CA- FPBA -DO在PBS中的稳定性（n = 3个独立样本）。f、g 不同浓度过氧化氢（0.1 mM与1 mM）条件下CAPE- FPBA -DO（0.5 mg mL-1）与CA- FPBA -DO（0.5 mg mL-1）的体外累积药物释放。不含过氧化氢的PBS作为对照（n = 3个独立样本）。h ABTS •+与抗氧化剂的反应机制。i 顺利获得 ABTS 法评估CAPE、CA、2- FPBA 、CAPE- FPBA -DO及CA- FPBADO 的ROS清除活性（n = 3个独立样本）。

（2）载药人工杂合膜胞外囊泡 C@AH-EVs 的构建与理化表征

研究团队完成了 C@AH-EVs 的构建与全面表征。一是顺利获得超声融合与挤出法成功制备巨噬细胞膜 - 线粒体膜杂合囊泡，共聚焦成像证实两种膜实现有效融合；二是 SEM 与 TEM 显示 AH-EVs 与 C@AH-EVs 均为规则球形，具有典型磷脂双分子层结构；三是 Western blot 证实 C@AH-EVs 完整保留了巨噬细胞膜特征蛋白 F4/80、线粒体膜特征蛋白 Bcl-2 与细胞膜内参 Na+/K+ ATPase；四是粒径与电位检测显示 C@AH-EVs 平均粒径 196 nm，与空白囊泡无显著差异，二者均呈负电位且无统计学差异；五是 HPLC 检测显示 C@AH-EVs 对前药的包封率达 69%，载药量为 403 ng/10^10 个颗粒；六是稳定性实验证实其在 PBS 与 RPMI 培养基中 72 h 内粒径稳定，且体外细胞实验与体内组织学分析验证了其良好的生物安全性。

图3. C@AH-EVs的构建与表征。a C@AH-EVs制备流程示意图。b 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）拍摄的C@AH-EVs图像。黄色荧光合并图像显示巨噬细胞膜（MM，DiO标记，绿色）与线粒体膜（MitoM，DiI标记，红色）的融合。比例尺：200 nm。 CLSM 图数据来自三次独立实验的代表性结果。c AH-EVs与C@AH-EVs的扫描电子显微镜（SEM）图像。比例尺：500 nm。SEM图像数据来自三次独立实验的代表性结果。d AH-EVs与C@AH-EVs的透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺：500 nm。TEM图像数据来自三次独立实验的代表性结果。e 蛋白质印迹分析显示的MM、MitoM、AH-EVs及C@AH-EVs特征性蛋白条带。免疫印迹数据来自三次独立实验的代表性结果。f AH-EVs与C@AH-EVs的粒径分布。粒径分析数据来自三次独立实验的代表性结果。g AH-EVs与C@AH-EVs的Zeta电位（n=3个生物学独立样本）。h C@AH-EVs的载药量与包封率（n=3个生物学独立样本）。i C@AH-EVs在PBS与 RPMI 培养基中分别培养72小时后的直径变化（n=3个生物学独立样本）。

（3）体外与体内环境下 C@AH-EVs 与巨噬细胞线粒体的共定位分析

研究团队系统验证了 C@AH-EVs 的线粒体靶向能力。一是体外细胞实验显示，与仅巨噬细胞膜制备的囊泡相比，C@AH-EVs 与线粒体示踪剂的共定位系数显著更高，证实线粒体膜赋予了囊泡优异的线粒体靶向能力，且该靶向不依赖线粒体膜电位，弥补了传统靶向元件的缺陷；二是在 LPS 诱导的炎症巨噬细胞模型中，C@AH-EVs 仍保持高效的线粒体靶向效率；三是体内糖尿病创面小鼠模型中，组织免疫荧光染色显示 C@AH-EVs 可高效富集于创面巨噬细胞内，并与线粒体实现高度共定位，在正常与糖尿病创面中均展现出优异的靶向性能，为其 mtROS 精准调控奠定了核心基础。

图4. C@AH-EVs与巨噬细胞线粒体的共定位（体外及体内实验）。a 实验流程示意图。将RAW 264.7细胞与DiO标记的纳米囊泡共孵育12小时后进行免疫荧光分析。 CLSM 图像(b)与共定位分析(c)显示C@AM-EVs和C@AH-EVs的线粒体定位。合并 CLSM 图像中白色荧光区域表示线粒体与纳米囊泡的共定位。线粒体采用MitoTracker深红（品红）染色，细胞核采用Hoechst染色。（蓝色）。比例尺为5 μm 。 CLSM 图像是三次独立实验的代表性数据。 CLSM 图像(d)与共定位分析(e)显示伤口组织巨噬细胞中C@AH-EVs与线粒体的共定位。品红色：F4/80，绿色：Tom20，红色：DiI，蓝色：Hoechst。比例尺为40 μm 。Rr：Pearson相关系数。 CLSM 图像为三只小鼠的代表性数据。

（4）C@AH-EVs 被巨噬细胞内吞及线粒体靶向的分子机制

研究团队阐明了 C@AH-EVs 内吞与线粒体靶向的分子机制。一是胰蛋白酶消化实验证实，膜蛋白是囊泡同源靶向的核心基础，巨噬细胞膜蛋白降解会显著降低囊泡内吞效率，线粒体膜蛋白降解则会大幅削弱其线粒体共定位水平；二是内吞途径抑制剂实验证实，C@AH-EVs 主要顺利获得脂筏与网格蛋白介导的内吞途径进入巨噬细胞，两种抑制剂分别使内吞效率降至对照组的 52.8% 与 66.2%，且该内吞过程为能量依赖型；三是线粒体 - 囊泡融合实验与 TEM 成像显示，C@AH-EVs 可与线粒体外膜高效融合，而线粒体融合蛋白抑制剂 MFI8 可完全阻断该过程，证实囊泡与线粒体的融合由 MFN 蛋白介导完成。

图5. 巨噬细胞内吞作用及C@AH-EVs线粒体定位的机制示意图。代表性 CLSM 图像(a)与分析(b)显示巨噬细胞摄取DiI标记纳米囊泡的过程。红色：DiI，蓝色：Hoechst。比例尺：10 μm（n = 3个生物学独立样本）。 CLSM 图像(c)与共定位分析（d，e）显示纳米囊泡的线粒体定位。合并 CLSM 图像中白色荧光区域表示共定位区域。线粒体用MitoTracker深红（品红）染色，细胞核用Hoechst（蓝色）染色。Rr：Pearson相关系数。比例尺：5 μm 。 CLSM 图像数据来自三次独立实验。f 内吞途径选择性药物抑制剂示意图。RAW 264.7细胞经选择性药物抑制剂预处理后与DiI标记纳米囊泡共孵育。顺利获得 CLSM (g)观察细胞摄取纳米囊泡情况，并定量分析其荧光强度(h)。红色：DiI，蓝色：Hoechst。比例尺：10 μm（n = 4个生物学独立样本）。i 融合实验示意图。经PBS或MFI8预处理的线粒体与指定纳米囊泡在37℃共孵育60分钟。代表性TEM图像(j)与融合效率分析(k)显示线粒体与纳米囊泡的融合。M：线粒体；V：纳米囊泡。比例尺：500 nm（n = 4个生物学独立样本）。

（5）C@AH-EVs 顺利获得清除 mtROS 调控巨噬细胞线粒体功能

研究团队证实了 C@AH-EVs 对线粒体功能的修复作用。一是 HPLC 检测显示，炎症巨噬细胞中 C@AH-EVs 可在线粒体内实现 CAPE 的高效响应性释放，释放量显著高于正常巨噬细胞；二是 MitoSOX 染色显示 C@AH-EVs 可显著降低炎症巨噬细胞的 mtROS 水平，空白囊泡无此作用，游离前药效果无统计学意义；三是流式检测证实 C@AH-EVs 可显著抑制线粒体脂质过氧化，有效逆转线粒体膜电位去极化；四是 TEM 成像显示其可显著改善线粒体肿胀、嵴结构囊泡化等病理损伤，恢复线粒体正常形态；五是 ATP 检测显示 C@AH-EVs 处理后炎症巨噬细胞的 ATP 生成水平较 PBS 组提升 2.72 倍，显著优于游离前药与空白囊泡组。

图6. C@AH-EVs顺利获得清除线粒体活性氧（mtROS）调节线粒体功能。代表性 CLSM 图像(a)及定量分析(b)显示经PBS、AH-EVs、CAPE- FPBA -DO和C@AH-EVs处理24小时的RAW 264.7细胞中MitoSOX荧光信号。红色：MitoSOX，蓝色：Hoechst。比例尺：20 μm（n = 3个生物学独立样本）。c 流式细胞术分析RAW 264.7细胞线粒体（Mito）脂质过氧化（n = 3个生物学独立样本）。d JC -1染色评估线粒体去极化的示意图。 JC -1以电位依赖性方式在线粒体内积累。进入线粒体后，其开始形成J聚集体（红色）。相反，当线粒体去极化时， JC -1以单体形式存在（绿色）。e 流式细胞术图谱显示经PBS、AH-EVs、CAPE- FPBA -DO和C@AH-EVs处理的RAW 264.7细胞中 JC -1聚集体与单体分布。图谱数据来自三次独立实验。f 经PBS、AH-EVs、CAPE- FPBA -DO和C@AH-EVs处理的RAW 264.7细胞线粒体超微结构透射电镜图像。比例尺：500 nm 。g 不同处理组线粒体长宽比的统计分析（n = 55（对照组）、52（PBS组）、56（AH-EVs组）、58（CAPE- FPBA -DO组）、60（C@AH-EVs组）线粒体）。h 经PBS、AH-EVs、CAPE- FPBA -DO和C@AH-EVs处理的RAW 264.7细胞中ATP水平（n = 3个生物学独立样本）。i C@AH-EVs改善RAW 264.7细胞线粒体功能的示意图。

（6）体外环境下 C@AH-EVs 对巨噬细胞表型的调控作用

研究团队验证了 C@AH-EVs 对巨噬细胞表型的精准调控作用。一是在 LPS 诱导的 M1 样巨噬细胞模型中，C@AH-EVs 可显著下调 M1 标志物 CD86 的表达，抑制 Tnfα、Nos2 等促炎基因转录；二是在 IL-4 诱导的 M2 极化模型中，C@AH-EVs 与 IL-4 发挥协同作用，显著上调 M2 标志物 CD206 的表达，大幅提升 Arg1、Mrc1 等抗炎基因转录，高效驱动巨噬细胞向 M2 样表型转化；三是空白囊泡无表型调控作用，游离前药效果显著弱于 C@AH-EVs；四是对照实验显示，直接负载 CAPE 的囊泡虽可降低 mtROS 与 M1 型细胞比例，但无法有效促进 M2 极化，证实 C@AH-EVs 的按需释药模式可避免 mtROS 过度清除，实现巨噬细胞表型的精准调控。

图7. C@AH-EVs在体外调控巨噬细胞表型。a 实验流程示意图。RAW 264.7细胞经LPS刺激12小时后，分别用PBS、AH-EVs、CAPE- FPBA -DO及C@AH-EVs处理24小时，未处理巨噬细胞作为对照。b CD86+巨噬细胞流式细胞术分析（n=3个生物学独立样本）。c 炎症相关基因（Tnfα 、Nos2、Il6和Cxcl1）的相对mRNA表达量（n=3个生物学独立样本）。d 实验流程示意图。RAW 264.7细胞经LPS预刺激12小时后，分别用PBS、AH-EVs、CAPE- FPBA -DO及C@AH-EVs（均联合IL-4处理）处理24小时，未处理巨噬细胞作为对照。e CD206+巨噬细胞流式细胞术分析（n=3个生物学独立样本）。f 抗炎基因（Arg1、Mrc1、Ym1和Fizz1）的相对mRNA表达量（n=3个生物学独立样本）。

（7）体内环境下 C@AH-EVs 顺利获得清除 mtROS 促进巨噬细胞向 M2 样表型极化

研究团队证实了 C@AH-EVs 的体内抗炎与表型重编程作用。一是在糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面模型中，C@AH-EVs 给药后，第 3、7、14 天创面巨噬细胞 mtROS 水平分别降至对照组的 32.4%、22.6%、26.4%；二是流式检测显示，C@AH-EVs 处理后 M1 样巨噬细胞比例持续下降，第 3、7、14 天分别降至 43.1%、38.1%、19.1%，M2 样巨噬细胞比例同期分别升至 39.7%、56.9%、72.2%；三是 ELISA 检测证实，C@AH-EVs 可显著下调创面 TNF-α、IL-1β 等促炎因子水平，上调 TGF-β、IL-10 等抗炎因子表达；四是空白囊泡无显著调控作用，游离前药的体内效果显著弱于 C@AH-EVs。

图8. C@AH-EVs顺利获得清除线粒体活性氧（mtROS）在体内促进M2样巨噬细胞极化。流式细胞术分析糖尿病伤口中巨噬细胞mtROS含量（治疗后第3天a、第7天c、第14天e，n=4个生物学独立样本）。分析糖尿病伤口中M2样巨噬细胞比例（治疗后第3天b、第7天d、第14天f，n=4个生物学独立样本）。

（8）C@AH-EVs 加速糖尿病小鼠创面闭合的治疗效果评价

研究团队系统评价了 C@AH-EVs 的体内创面治疗效果。一是宏观创面成像与定量分析显示，C@AH-EVs 可显著加速创面闭合，给药第 10 天愈合率达 78.2%，第 14 天达 86.3%，均显著优于 PBS 组、空白囊泡组与游离前药组；二是 H&E 染色显示，C@AH-EVs 可显著减少创面早期炎症浸润，第 7 天即可实现表皮再生，第 14 天完成再上皮化，同时实现毛囊、皮脂腺等皮肤附属器的高效再生，肉芽组织成熟度显著优于对照组；三是免疫荧光染色证实，C@AH-EVs 可显著上调创面 CD31 与 VEGF 的表达，相对覆盖面积分别为 PBS 组的 3.80 倍与 5.59 倍，强效促进新生血管形成；四是 Masson 染色显示其创面胶原体积分数达 51.86%，胶原纤维排列更致密有序，且治疗效果优于临床常用药物贝复济，展现出优异的临床转化潜力。

图9. C@AH-EVs加速糖尿病小鼠伤口闭合。a C@AH-EVs治疗效果体内评估实验流程示意图。治疗期间各组伤口数码照片(b)及伤口闭合轨迹(c)。比例尺：5毫米。数码照片为6个生物学独立伤口的代表性数据。d 伤口闭合率随时间变化的定量分析（n=6个生物学独立伤口）。e 按上述方法处理的伤口组织在第3天、第7天和第14天的H&E图像。比例尺：标准化图像1000 μm ，放大图像100 μm 。H&E图像为4个生物学独立伤口的代表性数据。