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针对上述问题，四川大学生物医学工程学院张兴栋团队采用 DLP 数字光固化 3D 打印搭配分步梯度高温二次烧结技术，制备内核致密高强度、外表多孔高生物活性双层梯度钙磷支架（GBC），并将锰铁普鲁士蓝纳米酶（MnFePBA）固载于支架表层多孔结构。该纳米酶具备优异近红外光热特性，808 nm 近红外光照射可精准破坏配位键实现 Mn²⁺可控缓释，同时依托类 SOD、类 CAT 双纳米酶活性高效清除局部过量 ROS，双重作用协同调控巨噬极化、重塑促再生免疫微。体外理化、细胞、多组学实验结合大鼠颅骨临界缺损体内模型系统验证材料抗炎、抗氧化、促成骨功效。该文章于 2026年5月26日以《Near-Infrared Responsive Property and Nanozyme Effect-Mediated 3D-Printed Gradient Bioactive Scaffold for Intelligent Immunomodulation in Regeneration of Large Segmental Bone Defects》为题发表于《Small》（DOI：10.1002/smll.202514837）。

示意图1. 功能化双增强MnFePBA&GBC集成骨修复平台的构建及其在促进术后植入骨再生中的智能响应应用。

（1）MnFePBA的合成、优化与表征

顺利获得水热单前驱体法合成了一系列不同Mn投料比的MnFePBA样品（分别命名为MnFePBA 0.6#、0.9#和1.2#）。扫描电子显微镜（SEM）表征显示，MnFePBA与PB共享均匀的立方晶体结构，但Mn投料比升高导致表面不稳定坍塌，而MnFePBA 0.6#保持了均一完整的形貌（图1b）。粒径分析表明Mn离子投料比与MnFePBA粒径呈正相关：MnFePBA 0.6#平均粒径约412 nm，0.9#和1.2#分别增至约780 nm和1060 nm，纯PB粒径约280 nm（图1c）。随着Mn离子投料比增加，溶液和粉末颜色由深蓝逐渐变为浅蓝（图1d）。能谱分析（EDS）证实了Mn、Fe、C、N在MnFePBA 0.6#中的均匀分布（图1e）。透射电镜（TEM）和选区电子衍射（SAED）分析表明PB和MnFePBA 0.6#均具有面心立方（Fm-3m）晶体结构（图1f）。X射线衍射（XRD）图谱证实MnFePBA成功掺入PB晶格，主要衍射峰向低角度偏移（图1g）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示不同投料比MnFePBA的—C≡N—伸缩振动峰位置和强度存在差异（图1h）。综合以上结果，MnFePBA 0.6#被选定为后续研究的功能粒子（简称为MnFePBA）。

图1.MnFePBA的形貌与结构。（a）制备方法及模拟结构示意图。（b）PB和不同Mn投料比MnFePBA的SEM图像。（c）Zeta电位粒径分布曲线（n=3）。（d）PB和不同Mn投料比MnFePBA水溶液颜色变化照片。（e）MnFePBA 0.6#的EDS能谱。（f）PB和MnFePBA 0.6#的TEM图像及对应SAED图谱。（g）不同Mn投料比MnFePBA的XRD图谱。（h）不同Mn投料比MnFePBA的FTIR光谱。

（2）3D打印CaP基梯度生物活性陶瓷（GBC）的制备与表征

顺利获得DLP 3D打印制备CaSO₄/羟基磷灰石（HAP）陶瓷生坯，经梯度烧结取得增强型CaP基陶瓷支架。将支架表面浸渍纳米羟基磷灰石（nHAP）浆料后于1100°C二次烧结，表面nHAP形成高孔隙外层，内部进一步致密化，构建"内部致密、外部多孔"的梯度结构。以乙二醇为分散介质、0.5 g·mL⁻¹ nHAP悬液为最优条件，一次涂覆（10HAP）支架内层覆盖不完整，底层大HAP颗粒暴露；三次（30HAP）和六次涂覆（60HAP）支架被无裂纹的松散多孔nHAP层完全覆盖，保留DLP打印内支架的层级结构（图2c）。支架大孔尺寸约400 μm，BET比表面积6.685 m²·g⁻¹，60HAP外层厚度达22.12 μm，30HAP和60HAP均实现100%表面覆盖，表面孔隙率增至22.17%（图2b），比表面积随涂覆次数增加而增大，孔径分布发生相应变化（图2e）。

将支架在无水乙醇中超声处理1、2、20和120分钟后，nHAP层保留，多孔结构完整。65%孔隙率陶瓷中，30HAP支架压缩强度约13.1 MPa，60HAP支架达16.4 MPa，较原始均质结构支架提升150%–200%，较纯HA多孔支架（约2 MPa）提升600%–700%（图2i），二次烧结为局部致密化给予热力学驱动力，有效修复陶瓷基体微缺陷。

图2.双增强HA基支架的制备与物理性能。（a）制备流程示意图。（b）不同外部涂覆次数HAP支架松散nHA涂层的表面孔隙率和覆盖率。（c）支架表面放大SEM图像。（d）支架截面SEM图像。（e）比表面积及表面孔径分布分析。（f）增强调控机制示意图。（g和h）双增强支架力学增强的视觉对比。（i）双增强与未增强支架的压缩强度（n=3）（p ≤0.05，p ≤0.01，p ≤0.01）。（j）双增强支架与传统晶须增强支架的应力-应变曲线。

（3）负载MnFePBA的CaP基梯度生物活性陶瓷（GBC）的表征

UV–vis–NIR光谱显示MnFePBA在NIR区域具有高吸收峰（图3b），证实其光热转换能力。不同浓度MnFePBA水溶液（0.25–2.0 mg·mL⁻¹）在808 nm NIR照射（0.69–1.01 W·cm⁻²）下温度随浓度和功率密度升高而显著上升，2.0MnFePBA溶液10分钟内达50.5°C，1.01 W·cm⁻²下可达60°C（图3a，c）。SEM证实MnFePBA颗粒均匀嵌入GBC表面微孔中（图3d，e）。MnFePBA&GBC支架的光热效应与pH响应协同实现Mn离子的智能可控释放：NIR照射的2.0MnFePBA&GBC组Mn²⁺释放显著高于未照射组，且高于双倍负载量（4.0MnFePBA&GBC）无NIR照射组的1.5倍，第三天累积释放从1.3 mg增至1.8 mg（图3f–h）。CCK-8检测显示≤4.0 mg·mL⁻¹ MnFePBA负载无细胞毒性；CLSM观察表明2.0和0.5 mg·mL⁻¹ MnFePBA&GBC上MC3T3-E1细胞增殖水平更高，第7天细胞均匀分布且死亡极少（图3j）。BMSCs在2.0 mg·mL⁻¹ MnFePBA&GBC上呈正常铺展模式，广泛铺展且突起减少（图3l），归因于nHAP层改性表面形貌增加的粗糙度。

图3.MnFePBA&GBC的响应性离子释放与体外生物相容性验证。不同粒子在0.8 W·cm⁻² NIR照射下的水溶液：（a）红外热成像图。（b）UV–vis–NIR光谱。（c）升温曲线。（d）MnFePBA&GBC的制备示意图。（e）表面放大SEM图像。（f–i）不同负载量MnFePBA&GBC在NIR"开/关"条件下的锰（Mn）和铁（Fe）离子释放行为（n=3）。评估MC3T3-E1细胞在不同支架上的增殖：（j）活细胞染色的典型CLSM图像。（k）CCK-8检测结果（n=3）（p ≤0.05，p ≤0.01，p ≤0.01）。（l）接种于2.0MnFePBA-HA支架的BMSCs粘附免疫荧光染色图像。

（4）MnFePBA&GBC体外纳米酶活性用于ROS清除与免疫调控

SOD模拟活性随MnFePBA&GBC负载浓度升高而增强，NIR照射在等效浓度下将抑制率从约30%提升至超过60%，同浓度下可控离子释放进一步将抑制率提高约10%（图4b）。芬顿反应产生的·OH经对苯二甲酸检测显示，MnFePBA&GBC组·OH水平显著低于HA组，证实其可有效清除H₂O₂和·OH（图4c）。TEM观察LPS刺激模型细胞吞噬MnFePBA后的超微结构，内质网和线粒体未出现明显破坏，所有细胞器保持正常形态（图4d）。DCFH-DA荧光探针结合CLSM显示，2.0MnFePBA&GBC和0.5MnFePBA&GBC组绿色荧光强度均明显低于HA组，NIR照射后信号进一步减弱（图4e）。NIR激发触发增强的Mn离子释放，驱动巨噬细胞从M1向M2极化以增强ROS清除（图4k）。流式细胞术定量显示，LPS刺激阳性对照中CD86⁺和CD206⁺细胞分别占53.8%和44.5%，HA组为51.4%和46.1%；0.5MnFePBA&GBC处理后CD86⁺降至49.9%，CD206⁺增至49.3%，2.0MnFePBA&GBC组为51.6%和47.3%。NIR照射后0.5MnFePBA&GBC ON组CD86⁺降至47.1%，CD206⁺增至52%，证实NIR强化M2极化促进炎症消退。BMSCs共培养14天转录组分析显示，NIR照射的2.0MnFePBA&GBC组有368个DEGs（288个下调，80个上调），所有指标与HA组均具统计学显著差异（图4g-h）。GO富集分析表明，NIR/光热触发离子释放主要影响细胞表面受体信号通路、免疫应答、信号受体结合和膜相关细胞组分；2.0MnFePBA&GBC组显著抑制细胞因子介导的免疫应答（图4i），同时增强细胞因子-细胞因子受体相互作用（图4j），证实其顺利获得调控关键免疫应答有效缓解植入相关免疫炎症。

图4.MnFePBA&GBC体外免疫调节机制。（a）MnFePBA&GBC纳米酶活性示意图。不同浓度MnFePBA在NIR开/关条件下的：（b）超氧化物歧化酶模拟催化活性（n=3）。（c）羟基自由基清除能力（n=3）。（d）细胞摄取超微结构图像。（e）体外ROS清除效果的CLSM图像。（f）流式细胞术分析图。BMSCs转录组分析：（g）差异表达基因（DEGs）火山图。（h）DEGs聚类热图。（i和j）基于BP、CC和MF过程中20个显著下调富集通路和10个典型免疫相关富集通路的GO结果圈图。（k）MnFePBA&GBC对RAW巨噬细胞调控效应示意图。

（5）MnFePBA&GBC体外成骨性能评价

BMSCs与各配方支架（0.5MnFePBA&GBC ON、0.5MnFePBA&GBC OFF、2.0MnFePBA&GBC ON、2.0MnFePBA&GBC OFF及纯HA）共培养后，SEM观察显示细胞在所有支架表面充分铺展并牢固粘附，证实支架具有良好的生物相容性（图5a）。成骨诱导第7天和第14天，所有MnFePBA&GBC支架组ALP活性均显著高于HAP对照组，且MnFePBA含量与ALP活性呈正剂量依赖关系（图5b）。茜素红S染色显示，14天诱导后所有支架组均出现明显钙结节，0.5MnFePBA&GBC和2.0MnFePBA&GBC组钙结节数量更多、分布面积更大（图5c），表明MnFePBA&GBC支架具有更优的成骨诱导能力，外部nHAP层补偿了双烧结导致的固有生物活性降低。免疫荧光染色显示，第14天MnFePBA&GBC组BMP-2和COL-1荧光强度均显著高于HAP组，且随MnFePBA浓度增加而逐渐增强（图5d，e），MnFePBA的过氧化氢酶样活性清除H₂O₂可能部分归因于COL-1表达上调。转录组GO富集分析显示，与HA组相比，MnFePBA&GBC组中五个与成骨钙化和钙离子沉积相关的关键通路显著富集（图5f，g），证实MnFePBA的引入和多孔nHAP表面协同促进BMSC成骨分化。所有成骨性能检测中细胞均与支架浸提液共培养，表明MnFePBA&GBC支架的微量离子释放是增强成骨分化的主要机制。

图5.MnFePBA&GBC对BMSCs成骨分化诱导效应。（a）体外设计示意图。（b）成骨培养基刺激7天和14天后各处理组BMSCs的ARS和（c）ALP染色。（d）成骨培养基刺激14天后不同处理组BMSCs的BMP-2和COL-1表达免疫荧光染色（蓝色为细胞核，红色为细胞骨架，绿色为BMP-2和COL-1阳性表达）。（e）ImageJ定量的表达水平统计图。（f）2.0MnFePBA&GBC与HA处理14天BMSCs的转录组分析（n=3）（p ≤0.05，p ≤0.01，p ≤0.01）。（g）基于BP、CC和MF过程中20个显著下调富集通路的GO结果。

（6）MnFePBA&GBC在大鼠体内颅骨缺损模型中的骨再生疗效

为评估MnFePBA&GBC的免疫调控和成骨潜力，在8周龄SD大鼠颅骨两侧建立双侧临界尺寸缺损（φ=5 mm），随机植入HA支架和2.0MnFePBA&GBC支架，术后1、4、8周取材分析。术后4周宏观检查显示，2.0MnFePBA&GBC被新生组织完全包裹，原始支架结构几乎难以辨认。Micro-CT评估显示，2.0MnFePBA&GBC和0.5MnFePBA&GBC组新骨体积显著大于HA组和空白对照组（图6a）。BV/TV定量分析表明，2.0MnFePBA&GBC组（52.43%±0.22%和57.74%±1.62%）和0.5MnFePBA&GBC组（50.80%±1.18%和51.46%±2.39%）在4周和8周均显著高于HA组（31.80%±5.86%和40.65%±2.26%）及空白对照组（5.94%±2.45%和12.71%±0.56%）。MnFePBA&GBC组BS/BV呈下降趋势，2.0MnFePBA&GBC在4周和8周显著低于HA组。BMD-BV随Tb.Th和Tb.Conn.D增加及Tb.Sp降低而增加，提示新生骨组织发育更充分（图6b–h）。3D重建显示MnFePBA&GBC组新骨长入更充分、结构更致密；第8周新生骨大幅增加，界面间隙消除，骨形态更成熟。H&E和Masson染色显示，MnFePBA&GBC组新生骨形成面积显著大于HA和空白对照组，骨组织沿支架孔隙内壁生长（图6i，j）。植入后4周，所有支架组骨形成厚度均超过20 μm，GBC组片状骨厚度超过200 μm；新生骨形成呈MnFePBA浓度依赖性增加。植入后8周，所有组片状骨厚度均超过100 μm，2.0MnFePBA&GBC和0.5MnFePBA&GBC组骨形成体积显著大于HA组。

图6.MnFePBA&GBC增强大鼠颅骨缺损模型体内骨再生。（a）不同材料骨组织再生的计算机断层扫描（CT）评估，包括3D重建、单层扫描图像和修复后植入物图像（S：支架，NB：新骨）。（b–h）不同时间点长入骨Micro-CT参数（n=4）（p ≤0.05，p ≤0.01，p ≤0.01）。（i）4周（上图）和8周（下图）的苏木精-伊红（H&E）和（j）马松三色染色。

（7）MnFePBA&GBC体内成骨机制与抗炎调控效应

免疫荧光分析显示，MnFePBA&GBC组在术后各时间点骨桥蛋白（OPN）、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达信号强度均显著高于HA组（图7b），且2.0MnFePBA&GBC组荧光强度最强，证实Mn离子持续释放与免疫调控机制协同增强了成骨潜力。术后一周（炎症关键窗口期）对2.0MnFePBA&GBC与HA组进行比较，免疫荧光染色显示前者支架内及周围CD206（M2标志物）表达显著上调，iNOS（M1标志物）表达显著下调（图7c）；支架取出后外观显示内部被半透明纤维结缔组织完全填充，支架形态仍清晰可见（图7d）。qPCR（图7e、f）和WB（图7g）进一步证实，MnFePBA&GBC释放的Mn离子显著上调CD206表达，同时显著下调iNOS和CCR7表达。上述结果表明，MnFePBA与外层设计的协同整合顺利获得免疫调控、抗氧化及骨诱导性的多重作用有效促进了骨缺损再生。

图7.MnFePBA&GBC在大鼠颅骨缺损模型中对免疫和巨噬细胞极化的体内调控效应。（a）体内骨再生评估示意图。（b）不同支架组织切片的OPN（红色）、BMP-2（绿色）和VEGF（黄色）免疫荧光染色。（c）CD206（红色）和iNOS（红色）免疫荧光染色。（d）体内植入4周后2.0MnFePBA&HA和HA植入物在颅骨缺损中的组织照片。（e，f）qPCR分析显示CD206和iNOS的基因表达水平，以及（g）体内植入1周后支架及其周围组织中CD206、iNOS和CCR7的蛋白质免疫印迹（WB）分析（n=3）（p ≤0.05，p ≤0.01，p ≤0.01）。