k8凯发软件

针对上述问题，重庆医科大学附属口腔医院杨生教授、李宇舟团队设计了一种具有超分子载药能力的可注射阳离子动态水凝胶（ICDH）：将苯硼酸接枝到阳离子ε-聚赖氨酸（ε-PLL）上，与聚乙烯醇（PVA）顺利获得动态硼酸酯键交联，并顺利获得超分子相互作用负载免疫调节药物绿原酸（CGA）和二甲双胍（MET）。该设计赋予ICDH强组织粘附性和对pH/葡萄糖/ROS的微环境响应性，实现对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及关键致病菌P.g的广谱抗菌，显著减轻牙周炎症和牙槽骨丢失。宿主转录组学揭示ICDH将中性粒细胞命运从NETosis重编程为凋亡并抑制破骨细胞生成；中性粒细胞-P.g共培养的双重RNA测序提示ICDH可跨宿主-微生物区室协同调控卟啉代谢，重建界面稳态。该文章于2025年11月17日以《Injectable cationic dynamic hydrogel with supramolecular drug loading reprograms neutrophil fate to alleviate diabetic periodontitis》为题发表于《Materials Today Bio》（DOI：10.1016/j.mtbio.2025.102557）。

方案1. ICDH的合成过程及作用机制示意图。a）ICDH的合成过程；b）建立DP小鼠模型；c）ICDH在DP微环境中表现出智能响应性降解与药物释放；d）ICH注射入牙周袋并黏附于袋内，从而减少NETs的释放并清除牙龈卟啉单胞菌（P.g）；e）ICDH顺利获得抑制PI3K通路的激活诱导中性粒细胞凋亡；f）ICDH直接杀灭P.g并协助中性粒细胞（Neu）抵抗P.g。

（1）ICDH的合成与表征

¹HNMR显示，ε-PLL的α-碳氢信号由3.818 ppm移至3.574 ppm，接枝比约1:2.36（图1b）；FTIR在3252、1638、1525及1016 cm⁻¹处出现特征峰，证实CPBA成功接枝（图1c）。MET与CGA顺利获得硼酸酯键、静电作用及π-π共轭实现负载（图1d）。3% PVA与1.5% ε-PLL-CPBA组合于37℃约60 s成胶，载药不影响成胶（图1e）；SEM显示三维多孔网络结构（图1f）。剪切速率0.1–10 s⁻¹内粘度由约10⁴ Pa·s降至约1 Pa·s，具剪切变稀性（图1h，i），可深入牙周袋复杂间隙（图1j），约1 s内快速自愈且拉伸强度不受影响（图1k，l）。牙-牙龈界面粘附强度最大（39.177 kPa），粘附能166.713 J·m⁻²（图1m-o）。

图1. ICDH的合成与表征。a) ε-PLL-PBA合成过程示意图；b) ε-PLL、CPBA和ε-PLL-PBA的质子核磁共振谱（α和β分别代表合成反应后裂分的ε-PLL α-¹H原子峰）；c) ε-PLL、CPBA和ε-PLL-PBA的FTIR光谱（I-V分别代表特征峰）；d) ICDH制备示意图；e) 不同ε-PLL与PVA（w/v）浓度混合后所需凝胶时间；f) 冻干后HG和ICDH水凝胶截面的代表性SEM图像；g) ICDH临床注射应用示意图；h) 载药与未载药水凝胶的挤出与成胶（HG：水凝胶；ICDH：双药载药水凝胶）；i) 四种不同水凝胶的剪切速率-粘度曲线（HG + MET：载MET水凝胶；HG + CGA：载CGA水凝胶）；j) 牙周袋模型填充实验（RGB光谱分割伪热图）；k) 哑铃形水凝胶自愈前后拉伸强度检测光学照片；l) 自愈前后哑铃形水凝胶拉伸强度曲线；m)-o) 不同界面组织粘附强度检测，m) 光学照片（T：牙；G：牙龈），n) 力-距离曲线，o) 粘附强度与粘附能（n = 3）。数据以平均值±SD表示（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，无显著性差异）。

（2）ICDH的智能响应性能

频率扫描显示ICDH具有良好的粘弹性：低频区（约0.1–10 rad/s）粘性占优，高频区（约10–100 rad/s）弹性占优（图2a）。在10–50℃范围内，ICDH的储能模量与损耗模量随温度升高仅轻微下降，整体保持G′ > G″的凝胶特性，表明其在口腔环境温度下稳定性良好（图2b）。溶胀实验显示水凝胶12 h内基本达到溶胀平衡，溶胀率适中（约130%–170%）（图2c）。DP炎症微环境以高ROS、低pH和高葡萄糖为特征，体外降解实验表明，ICDH在1% H₂O₂、稀盐酸（pH = 5.5）或葡萄糖溶液（2 g/L）中均发生响应性降解（图2d-g），并相应加速CGA和MET的释放（图2h，i）。经上述环境刺激处理后，水凝胶的储能模量和损耗模量均显著下降且损耗模量大于储能模量，提示内部结构解体（图2k-m）。此外，Cy5标记的体内示踪显示ICDH可在小鼠牙周炎模型中存留超过72 h，24 h滞留率达70%。综上，该水凝胶能响应炎症微环境特征降解并释放药物，同时在口腔温度变化下保持相对稳定。

图2. ICDH的智能响应。a) 不同组分ICDH的储能模量与损耗模量频率扫描；b) 5–50℃下ICDH储能模量与损耗模量变化曲线；c) ICDH溶胀曲线（w/w）；d)-g) 不同组分ICDH在低pH、高糖和高活性氧环境中的体外降解实验：d) HG，e) HG + CGA，f) HG + MET，g) ICDH；h)-i) 低pH、高糖和高活性氧环境中ICDH的CGA与MET释放速率：h) CGA释放浓度-时间曲线，i) MET释放浓度-时间曲线；j) ICDH智能响应降解示意图；k)-m) 低pH、高糖和高活性氧环境处理后ICDH储能模量与损耗模量的变化：k) 高活性氧（0.1% H₂O₂），l) 低pH（约5.5），m) 高糖（2 mg/ml）。

（3）ICDH对DP小鼠的体内治疗效果

采用STZ诱导小鼠1型糖尿病模型，经四联抗生素构建ABX模型后施加P.g，于第二磨牙（M2）处建立结扎诱导牙周炎模型，分别以HG、HG + MET、HG + CGA和ICDH隔天给药治疗一周（图3a）。Micro-CT显示，LIP组近中骨丢失均值为0.5749 mm（n = 5），ICDH治疗组降至0.3330 mm（P < 0.0001），总体疗效呈ICDH > HG + CGA > HG + MET > HG趋势（图3b，c）。HE染色显示，CTR组牙龈上皮完整陆续在、无明显炎症细胞浸润；DP + P.g组上皮坏死崩解、上皮下大量炎症细胞浸润；ICDH治疗组上皮完整陆续在，仅少量炎症细胞（图3d）。牙周组织bulk RNA测序显示，与DP + P.g组相比，ICDH治疗共改变713个基因转录水平，其中305个上调、408个下调（图3e）；KEGG富集分析显示差异基因主要涉及补体级联反应、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NETs形成、细胞外基质受体相互作用及破骨细胞分化（图3f）；GO分析显示富集生物过程主要包括胶原分泌与沉积、骨矿化与重塑及先天免疫反应（图3g）。TRAP染色显示，DP + P.g组牙槽骨及牙根表面可见大量TRAP阳性破骨细胞，ICDH治疗组未见明显TRAP阳性区域，HG + MET组亦无TRAP阳性细胞聚集，提示MET为ICDH体系中调控破骨细胞数量与功能的主要组分（图3h）。

图3. ICDH对DP小鼠的体内治疗效果。a) 丝线结扎诱导的P.g移植1型糖尿病小鼠牙周炎模型建立流程示意图；b) 小鼠牙槽骨Micro-CT代表性矢状切面及三维重建图像；c) 第二磨牙釉牙骨质界至牙槽骨最高点的近中距离（n = 5）；d) 小鼠牙槽骨组织HE染色切片及局部放大图（T：牙；G：牙龈）；e) 组织RNA测序中ICDH治疗组与DP + P.g疾病模型组差异表达基因火山图（n = 3）；f)-g) ICDH组与DP + P.g组差异表达基因的KEGG和GO富集分析；h) 小鼠牙槽骨组织切片TRAP染色及局部放大图，黄色箭头指向代表性TRAP阳性细胞。数据以平均值±SD表示（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，无显著性差异）。

（4）ICDH诱导中性粒细胞NETosis-凋亡命运转换

免疫荧光与3D重建显示，高糖环境下LPS刺激后中性粒细胞大量释放云团状NETs，含CGA组分的水凝胶可显著减少NETs释放，ICDH治疗组可见更多完整细胞核、无NETs产生（图4a，b）。Annexin V/PI双染流式检测显示，高糖环境中LPS刺激使中性粒细胞凋亡比例降至约20%，经HG + CGA或ICDH干预后回升至约30%，提示中性粒细胞由NETosis途径回归常规凋亡途径（图4c，d）。分子对接显示，CGA与PI3K/AKT通路蛋白（PI3K：4.0 kcal/mol，AKT：5.7 kcal/mol）、凋亡通路蛋白（Caspase-8：5.98 kcal/mol，Bcl-2：5.90 kcal/mol，Bax：4.72 kcal/mol）及NETosis通路蛋白（MPO：6.95 kcal/mol，NE：5.77 kcal/mol，PAD4：4.89 kcal/mol）均具有较低结合能，提示CGA是缓解凋亡延迟的主要组分（图4e，f）。免疫印迹证实，含CGA组分水凝胶处理后NE和MPO表达显著下降，AKT磷酸化水平降低，Bax表达升高、Bcl-2表达降低，cleaved caspase-3显著上调（图4g）。动物样本多重免疫荧光显示，DP + P.g组牙周上皮下大量CitH3积聚，ICDH治疗后可见cleaved-casp3与Ly6G共定位而CitH3未检出，证实ICDH在体内诱导中性粒细胞凋亡并减少NETs释放（图4h）。

图4. ICDH顺利获得NETosis向凋亡转换重编程中性粒细胞命运。a) 高糖条件下HG、HG + MET、HG + CGA和ICDH对LPS诱导的中性粒细胞NETs释放治疗效果的免疫荧光代表性图像；b) 共聚焦荧光显微镜3D重建图像，NETs显示于红色虚线区域内；c) 流式细胞术检测高糖环境下LPS处理后中性粒细胞凋亡水平及HG、HG + MET、HG + CGA和ICDH处理后凋亡水平变化；d) 流式细胞术统计分析；e) CGA与凋亡、NETosis及PI3K/AKT通路关键蛋白的分子对接模拟；f) 分子对接结合能统计分析；g) Western blot检测HG、HG + MET、HG + CGA和ICDH处理后LPS刺激中性粒细胞关键蛋白的表达水平；h) 动物实验样本多重免疫荧光染色代表性图像（白色箭头指示NETs，浅蓝色箭头指示凋亡中性粒细胞）。

（5）ICDH的抗菌能力

以大肠杆菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）及牙周病主要致病菌牙龈卟啉单胞菌（P.g）为模型评估抗菌性能。菌落形成实验与活/死细菌染色直观显示，四种组分水凝胶（HG、HG + MET、HG + CGA、ICDH）对三种细菌均具有优异的生长抑制和杀灭作用（图5a）。菌落计数显示，水凝胶使E.c和S.a菌落数由约200 CFU/100 μl降至约10 CFU/100 μl，P.g则由约100 CFU/100 μl降至无菌落形成（图5b）。ICDH在处理期内使三种细菌死亡率均超过50%，杀菌效力与阳性对照相当或更优（图5c）。生长曲线表明各组分水凝胶均可显著抑制细菌增殖，24 h内几乎无增殖（图5d）。SEM观察显示，经水凝胶浸提液处理4 h后，细菌细胞膜表面出现大量皱褶和凹陷，细胞膜破裂（图5e），提示ICDH可能顺利获得破坏细菌细胞膜发挥杀菌作用——ε-PLL作为阳离子抗菌剂破坏膜结构，CGA兼具破坏膜结构和生化抑制功能，二者协同实现强效广谱抗菌。

图5. ICDH的抗菌能力。a) E.c、S.a和P.g在含5%（v/v）PBS、50 μg/mL Amp或5%（v/v）四种组分（HG、HG + MET、HG + CGA、ICDH）水凝胶浸提液的培养基中培养6 h后的菌落形成实验及细菌活/死染色荧光图像（红色荧光：死菌；绿色荧光：活菌）；b) 菌落形成实验统计结果；c) 细菌活/死染色荧光统计结果；d) E.c、S.a和P.g在上述培养基中的增殖曲线；e) E.c、S.a和P.g经上述培养基处理4 h后的代表性SEM图像，方框标示对应区域。

（6）Dual-RNA seq揭示ICDH调控中性粒细胞-P.g互作的机制

中性粒细胞与P.g在正常及高糖（2 g/L）环境共培养后，免疫荧光显示产生大量附着CitH3的丝状、网状DNA（NETs），HG和HG + MET处理后无明显变化，HG + CGA或ICDH处理后丝状、网状DNA及CitH3均显著减少（图6a）。菌落形成实验显示，高糖环境利于P.g存活（超过300 CFU/100 μl），与中性粒细胞共培养后降至约150 CFU/100 μl，加入Amp、HG、HG + MET后降至约80 CFU/100 μl，ICDH和HG + CGA处理使P.g降至最低（约10 CFU/100 μl）（图6b，c）。双重RNA测序（Dual-RNA seq）单次测序同时获取宿主与微生物转录组信息（图6d）：与共培养组相比，ICDH处理后中性粒细胞2580个基因转录改变（1823个上调、757个下调）（图6e），P.g中214个基因改变（117个上调、97个下调）（图6f）。GO分析显示，中性粒细胞差异基因高度富集于铁-卟啉代谢、凋亡正调控、内体-溶酶体途径等过程（图6g），P.g差异基因集中于离子转运和铁硫簇蛋白组装过程（图6h）；KEGG富集结果在二者中均集中于卟啉代谢过程（图6i，j）。机制上，ICDH顺利获得三条途径干预Neu-P.g互作：CGA抑制PI3K/AKT通路激活，诱导NETosis-凋亡转换；中性粒细胞铁离子摄取储存相关基因（TRF、STEAP3、DMT1）及卟啉合成关键限速酶ALAD表达上调，构筑"离子-营养屏障"，使P.g处于缺铁环境（铁硫簇合成基因sufB、sufC代偿性上调）；NETs相关NE基因、促炎因子IL-1β及P.g毒力因子PgMA转录水平均下降，重建宿主-微生物界面稳态。

图6. 基于Dual-RNA seq的ICDH调控Neu-P.g互作机制。a) Neu-P.g共培养4 h后免疫荧光染色代表性图像；b) Neu-P.g共培养4 h后菌落形成实验代表性光学图像；c) Neu-P.g共培养4 h后菌落形成实验统计分析；d) Dual-RNA seq流程示意图；e) Dual-RNA seq中ICDH治疗组与DP + P.g疾病模型组之间中性粒细胞差异表达基因（DEGs）火山图；f) 两组间P.g差异表达基因火山图；g)-h) 中性粒细胞与P.g差异表达基因的GO富集分析；i)-j) 中性粒细胞与P.g差异表达基因的KEGG富集分析。数据以平均值±SD表示（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，无显著性差异）。