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针对上述问题，南通大学第二附属医院崔志明团队设计了一种可注射自愈合水凝胶系统（OCT-QM/AEVs@siRNA），顺利获得星形胶质细胞来源外泌体介导的siRNA靶向递送联合槲皮素-锰复合物（QM）抗氧化治疗，协同抑制A1型星形胶质细胞激活和神经元铁死亡，促进SCI后神经修复。该文章于2026年6月15日以《Astrocyte-derived exosome-mediated siRNA delivery combined with quercetin-Mn complex promotes neural repair in spinal cord injury》为题为题发表于《Journal of Controlled Release》（DOI: 10.1016/j.jconrel.2026.115104）。

方案1. OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶的制备过程示意图（A）及QM和AEVs@siRNA纳米颗粒用于SCI体内治疗的机制示意图（B）。

（1）RNA测序筛选SCI靶基因及AEVs@siRNA纳米颗粒的制备与表征

RNA测序分析SCI小鼠脊髓组织，共鉴定3368个差异表达基因（2185个上调，1183个下调）（图1A、B）。火山图显示Pttg1、Mmp12及Serpina3n等基因显著上调。GO富集分析表明差异基因主要参与免疫系统过程调控；KEGG分析显示TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和趋化因子信号通路显著富集（图1C-F）。Serpina3n被确定为关键靶基因，该基因在星形胶质细胞中高表达，可调控其反应性极化。

图1. 顺利获得RNA测序筛选SCI靶基因。(A)差异表达基因聚类热图。(B)差异表达基因火山图。(C–D)差异表达基因GO富集分析。(E–F)差异表达基因KEGG通路富集分析。

CS/HA纳米颗粒在HA/CS质量比1:1时粒径最小（72.75±11.29 nm），PDI为0.193±0.06，Zeta电位为13.78±1.46 mV（图2A-C）。siRNA与CS/HA质量比1:15时包封效率超过75%（图2D、E），CHS NPs粒径为88.41±3.21 nm（图2F）。差速超速离心提取AEVs，TEM显示典型杯状结构（图2G），NTA主峰位于115 nm（图2H），WB检测CD9、CD63、TSG101高表达（图2I）。AEVs@siRNA NPs粒径为125.25±2.87 nm，PDI为0.223±0.06，Zeta电位为-12.43±1.87 mV，TEM显示均匀球形结构（图2J）。AEVs@siRNA在RNase A和50% FBS中4-24 h保持稳定（图2K），4°C储存7天粒径无显著变化（图2L），包封效率约72.3±1.5%，载药量约4.6±0.5%。

图2. AEVs@siRNA纳米颗粒的表征。(A)不同HA/CS质量比制备的CS/HA纳米颗粒水动力学粒径分布；(B)不同HA/CS质量比制备的CS/HA纳米颗粒Zeta电位；(C)HA/CS质量比1:1时CS/HA纳米颗粒的形貌和光散射分析；(D)不同siRNA与CS/HA比例制备的CHS纳米颗粒琼脂糖凝胶电泳；(E)不同siRNA与CS/HA比例制备的CHS纳米颗粒siRNA包封效率；(F)CHS纳米颗粒水动力学粒径分布；(G)C8-D1A星形胶质细胞来源细胞外囊泡TEM图像（比例尺：200 nm）；(H)C8-D1A星形胶质细胞来源细胞外囊泡NTA结果；(I)C8-D1A星形胶质细胞及其细胞外囊泡标志蛋白（CD9、CD63、TSG101和Calnexin）WB分析；(J)AEVs@siRNA纳米颗粒TEM图像（比例尺：200 nm）；(K)AEVs@siRNA纳米颗粒在RNase A和50% FBS溶液中的稳定性琼脂糖凝胶电泳评估；(L)AEVs@siRNA纳米颗粒4°C储存1周的粒径测量。

（2）QM纳米颗粒的制备与表征及OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶的构建

Que与MnCl₂·4H₂O按1:1摩尔比在碱性环境中80°C回流反应6-8 h合成QM纳米颗粒。DLS测得QM平均粒径约135.62±1.34 nm，TEM显示不规则球形结构，平均粒径约120 nm（图3A）。Zeta电位：Que为-20.07 mV，MnCl₂为3.80 mV，QM为-15.73±1.58 mV（图3B）。UV-Vis光谱中Que最大吸收峰位于272 nm和375 nm，QM红移至303 nm（图3C）。FTIR显示Que中3000-3500 cm⁻¹的-OH伸缩振动峰在QM中减弱、展宽并移向低波数，1666 cm⁻¹的-C=O峰强度降低（图3D）。XPS证实QM含锰约26.57±3.12%（图3E）。H₂O₂清除实验显示QM抗氧化能力显著优于游离Que（图3F）。

图3. QM纳米颗粒的表征。(A)合成QM纳米颗粒的水动力学粒径分布和TEM图像（比例尺：500 nm）；(B)不同制剂的Zeta电位测量；(C)Que和QM纳米颗粒在240-600 nm范围内的UV-Vis吸收光谱；(D)Que和QM纳米颗粒的傅里叶变换红外（FTIR）光谱；(E)QM纳米颗粒的X射线光电子能谱（XPS）；(F)Que和QM纳米颗粒的H₂O₂清除效率。

OSA顺利获得高碘酸钠氧化SA制备，FTIR在1725 cm⁻¹处出现醛基特征峰（图4A、B）。OSA、CMCS和TA混合后3 min内凝胶化（图4C），切断后10 min内自修复（图4D），具有湿态组织粘附性（图4E）和可注射性（图4F）。SEM显示冻干OCT水凝胶为均匀有序三维多孔网络结构（图4G）。流变学测试：0.1-100 rad/s频率范围内G'始终高于G''（图4H）；低应变下G'>G''，高应变下G'下降、G''上升（图4I）。OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶在37°C PBS中7天约10%残留（图4J），60 min内达200%溶胀平衡（图4K）。Cy5-siRNA 144 h累积释放率83%（图4L）。

图4. OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶的表征。(A)海藻酸钠在高碘酸钠条件下形成氧化海藻酸钠的示意图；(B)氧化海藻酸钠和海藻酸钠的傅里叶变换红外光谱；(C)OCT水凝胶在室温下的凝胶形成图；(D)制备的OCT水凝胶自愈合过程图；(E)制备的OCT水凝胶体外粘附图；(F)制备的OCT水凝胶可注射性测试结果；(G)制备的OCT水凝胶扫描电子显微照片；(H)OCT水凝胶频率扫描图；(I)OCT水凝胶振幅扫描图；(J)OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶不同时间的体外溶蚀曲线；(K)OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶溶胀率曲线；(L)OCT-QM/AEVs@siRNA水凝胶siRNA释放曲线

（3）细胞摄取、溶酶体逃逸及体外星形胶质细胞激活抑制研究

AEVs@siRNA、QM/AEVs@siRNA和OCT-QM/AEVs@siRNA组在2、12、24 h的细胞摄取效率均显著高于游离siRNA组，荧光强度随时间递增并于24 h达峰值（图5A）。3D细胞球模型中，上述三组绿色荧光细胞均匀分布于球体内部（图5B）。溶酶体逃逸实验显示，AEVs@siRNA与C8-D1A细胞孵育2 h时FAM-siRNA与LysoTracker共定位较少，6 h时共定位显著增加，12 h时共定位区域逐渐减弱（图5C）。TNF-α/IL-1β刺激后Serpina3n表达显著上调，AEVs@siRNA和OCT-QM/AEVs@siRNA处理显著降低其表达，游离siRNA和AEVs组无显著影响（图5D）。

图5. 细胞摄取研究。(A)siRNA、AEVs@siRNA、QM/AEVs@siRNA或OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒与C8-D1A细胞孵育2、12和24 h后的细胞摄取；(B)siRNA、AEVs@siRNA、QM/AEVs@siRNA或OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒与神经细胞3D球体孵育24 h后在不同深度的分布；(C)AEVs@siRNA纳米颗粒处理2、6和12 h后的细胞内溶酶体逃逸；(D)WB检测Serpina3n表达（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。##p<0.01 vs.对照组。

TNF-α/IL-1β刺激显著增加C3和GFAP表达，AEVs@siRNA、QM/AEVs@siRNA和OCT-QM/AEVs@siRNA处理明显逆转C3表达（图6B）。TNF-α/IL-1β刺激显著上调p-IKKα+β和p-NFκB p65蛋白水平，上述三种纳米药物处理显著降低这些蛋白表达（图6C-E）。

图6. OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒对TNF-α/IL-1β诱导的C8-D1A星形胶质细胞激活的影响。(A)细胞实验示意图；(B)免疫荧光双染检测C3和GFAP表达；(C-E)WB检测p-IKKα+β和p-NFκB p65表达（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。##p<0.01 vs.对照组，**p<0.01 vs.TNF-α/IL-1β组。

（4）体外神经元铁死亡抑制研究及体内滞留与靶向性评估

H₂O₂刺激HT22细胞建立氧化损伤模型。TEM显示对照组线粒体呈正常椭圆形或长条形，膜结构清晰、嵴排列完整有序；H₂O₂刺激后线粒体明显皱缩、膜密度增加、嵴结构消失或紊乱、部分线粒体膜塌陷甚至破裂；QM、QM/AEVs@siRNA和OCT-QM/AEVs@siRNA预处理明显缓解上述结构改变（图7B）。DHE检测显示H₂O₂刺激显著增加ROS水平，三种纳米药物预处理明显逆转荧光强度变化（图7C）。3D细胞球实验中，H₂O₂刺激破坏细胞球结构完整性，三种纳米药物预处理明显改善细胞球形态、恢复其正常生长（图7D）。Fe²⁺检测显示H₂O₂刺激显著增加Fe²⁺水平，三种纳米药物预处理显著降低Fe²⁺水平（图7E）。MDA和GSH检测显示H₂O₂刺激显著增加MDA水平、降低GSH水平，纳米药物预处理显著逆转这些变化（图7F、G）。WB显示H₂O₂刺激显著降低SLC7A11和GPX4表达，三种纳米药物预处理显著恢复这些蛋白表达（图7H-J）。

图7. OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒对H₂O₂诱导的HT22神经元铁死亡的影响。(A)细胞实验示意图；(B)TEM观察神经元内线粒体形态结构；(C)DHE染色检测ROS水平；(D)神经细胞3D球体形态观察；(E)常规试剂盒检测Fe²⁺水平（n=6）；(F)常规试剂盒检测MDA水平（n=6）；(G)常规试剂盒检测GSH水平（n=6）；(H-I)WB检测SLC7A11和GPX4表达（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。##p<0.01 vs.对照组，**p<0.01 vs.TNF-α/IL-1β组。

Cy7标记siRNA小动物活体成像显示，游离siRNA组12 h无荧光信号，AEVs@siRNA和QM/AEVs@siRNA组48 h无荧光信号，OCT-QM/AEVs@siRNA组7天后脊髓组织仍可检测到荧光信号（图8A-C）。免疫荧光显示FAM标记的AEVs@siRNA与GFAP标记的活化星形胶质细胞明显共定位（图8D）。WB显示局部注射7天后，AEVs@siRNA组Serpina3n表达降低，OCT-QM/AEVs@siRNA组Serpina3n表达显著降低（图8E、F）。

图8. OCT-QM/AEVs@siRNA在小鼠脊髓组织中的滞留和靶向特性。(A)小动物成像系统对局部注射后siRNA纳米药物进行体内荧光监测，监测时间点为2、6、12、24 h、48 h和7天；(B-C)7天后分离脊髓的荧光成像观察（n=3）；(D)共聚焦扫描激光显微镜观察AEVs@siRNA荧光与活化星形胶质细胞标志蛋白的共定位成像；(E-F)WB检测Serpina3n表达（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。#p<0.05，##p<0.01 vs.对照组。

（5）SCI药效学评估及体内星形胶质细胞激活与神经元铁死亡抑制研究

小鼠脊髓压迫损伤模型，伤后第2天开始局部给药，每周一次，陆续在4周。假手术组后肢关节屈曲运动正常，SCI模型组完全缺失，OCT-QM/AEVs@siRNA干预组显著恢复关节屈曲运动（图9B）。SCI后BMS评分显著降低，OCT-QM/AEVs@siRNA治疗后显著升高（图9C）。SCI组MEP波形畸变、振幅降低、潜伏期延长，OCT-QM/AEVs@siRNA治疗显著增加振幅、缩短潜伏期（图9D-F）。SCI组步长显著低于假手术组，QM/AEVs@siRNA治疗显著增加步长（图9G、H）；SCI组最大倾斜角度显著降低，纳米药物治疗后显著增加（图9I）。SCI模型组脊髓损伤区域结构完整性丧失超过50%，伴出血、坏死、空洞形成及周围炎症细胞浸润和胶质瘢痕增生，QM/AEVs@siRNA治疗明显缓解上述病理变化（图9J）。

图9. OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒缓解SCI的药效学评估。(A)动物实验操作示意图；(B)SCI小鼠后肢功能观察；(C)局部给药后0、1、2、3和4周Basso小鼠量表（BMS）评分（n=10）；(D-F)给药后4周运动诱发电位（MEP）电生理评估（n=3）；(G-H)给药后4周步态分析（n=8）；(I)给药后4周斜板实验（n=8）；(J)H&E染色观察SCI后恢复情况。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。##p<0.01 vs.假手术组。*p<0.05，**p<0.01 vs.SCI组。

SCI显著增加GFAP表达，OCT-QM/AEVs@siRNA治疗4周后GFAP表达降低（图10A）；SCI组C3表达明显升高，OCT-QM/AEVs@siRNA治疗显著抑制C3表达（图10B）。SCI组p-IKKα+β和p-NFκB p65蛋白水平显著升高，OCT-QM/AEVs@siRNA治疗显著逆转这些蛋白表达（图10C-E）。

图10. OCT-QM/AEVs@siRNA对SCI诱导星形胶质细胞激活的影响。(A)免疫组化检测脊髓GFAP表达；(B)免疫组化检测脊髓C3表达；(C-E)WB检测p-IKKα+β和p-NFκB p65蛋白水平（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。##p<0.01 vs.假手术组。*p<0.05，**p<0.01 vs.SCI组。

SCI组神经元线粒体皱缩、内膜浓缩、嵴变小、密度降低，OCT-QM/AEVs@siRNA治疗明显逆转线粒体形态和功能改变（图11A）。SCI小鼠脊髓TUNEL阳性细胞数明显增多，纳米药物治疗后明显缓解（图11B）。SCI组神经元形态受损、排列紊乱、数量显著减少，纳米药物治疗后缓解（图11C）。SCI后SLC7A11和GPX4表达显著降低，QM/AEVs@siRNA治疗显著增加这些蛋白水平（图11D-F）。

图11. OCT-QM/AEVs@siRNA对SCI诱导神经元铁死亡的影响。(A)TEM观察脊髓线粒体形态结构；(B)TUNEL染色检测脊髓神经元凋亡；(C)Nissl染色评估神经元结构损伤；(D-F)WB检测SLC7A11和GPX4蛋白水平（n=3）。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验。数据以平均值±S.E.M.表示。##p<0.01 vs.假手术组。*p<0.05，**p<0.01 vs.SCI组

（6）生物安全性评估

为确定OCT-QM/AEVs@siRNA纳米颗粒在体内的生物安全性，研究团队将药物局部注射至正常小鼠脊髓组织，每周一次，陆续在4周，对照组注射等量生理盐水。给药4周后取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行H&E染色，结果显示各器官均未见明显炎症、坏死或其他病理变化：心肌组织肌纤维结构正常；肝组织无脂肪变性或炎症细胞浸润；脾组织白髓和红髓结构正常；肺组织肺泡壁无增厚或炎症细胞浸润；肾组织肾小球和肾小管结构正常（图12A）。血常规检测显示WBC、RBC、PLT和HGB水平均在正常范围内（图12B）；血清生化检测显示BUN、ALP、AST和ALT水平与对照组无显著差异（图12C）。此外，局部注射OCT-QM/AEVs@siRNA未对健康小鼠脊髓组织结构和细胞形态造成显著改变。上述结果表明该纳米药物具有优异的生物安全性，具备开发为新型SCI治疗药物的潜力。

图12. OCT-QM/AEVs@siRNA在小鼠中的生物安全性评估。(A)心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的H&E染色；(B)自动血细胞分析仪检测血液中WBC、RBC、PLT、HGB水平（n=6）；(C)全自动生化分析仪检测血清中BUN、ALP、AST和ALT水平（n=6）